Patolojik İnceleme Yöntemleri

1. Tanım
2. Patolojik yöntem ve yaklaşımlar
3. Rutin histopatolojik uygulamalar
• Tespit (fiksasyon)
• Takip (doku işleme)
• Bloklama
• Kesme
• Boyama
4. "Frozen section" ve intraoperatif konsültasyon
5. Sitolojik yöntemler
6. Sonuç

Tanım

Patoloji, eski yunanca hastalık anlamındaki 'pathos' teriminden türetilmiştir ve hastalıkların bilimsel yöntemlerle incelenmesi anlamında kullanılır. Daha geniş anlamıyla patoloji, hastalıklara yol açan nedenleri, bunların doku ve organları etkileme biçimlerini, hastalıklı doku ve organların özellikle morfolojik (biçimsel, görüntüsel) özelliklerini inceler. Bu anlamda patoloji, tıbbın temelini oluşturur.

Patolojik yöntem ve yaklaşımlar

Patolojinin bir tıp dalı olarak yöntemleri ve işleyişi diğer dallardan kısmen farklıdır. Klinik bir dal olmamasına rağmen, patoloji, çoğu kez klinik çalışmaların ya içinde yer alır veya çalışmalarından elde ettiği verilerle hastaların tanı ve tedavilerine doğrudan katkılarda bulunur. Patolojinin çalışma alanı hastalıklı organ ve dokuların incelenmesiyle sınırlı değildir. Deneysel, teorik ve teknik pek çok konuda patolojik çalışmalar yapılmaktadır.

Patolojik inceleme ve çalışmalar ancak yeterli anatomi, histoloji ve fizyoloji bilgisine sahip kişilerce yürütülebilir. Patolog, ilgili uzmanların bulunabildiği akademik ortamlar dışında, çoğu kez bu konulardaki klinik soruları en kolay cevaplayabilecek kişi konumundadır.

Bir hastanenin işleyişi içinde patoloji bölümünün katkısı; hastalardan tarama veya tanı amacıyla hücre/doku örneklerinin alınmasıyla veya organların çıkarılmasıyla başlar. Bu örneklerin önce dış görünümleri (makroskobi) değerlendirilir ve mikroskop altında incelenmesi gerekli görülen kısımlar seçilerek ayrılır. Patolojik incelemenin en kritik ve en çok deneyim gerektiren aşamasının bu olduğu kabul edilebilir. Patolojiyi en iyi yansıttığı düşünülen kısımlar örneklenip, çok ince (4-5 mikron kalınlıkta) kesitlerin alınabilmesine olanak verecek işlemlerden (doku takibi) geçirilir ve hazırlanan kesitler rutin olarak "hematoksilen-eosin" yöntemiyle boyanır. (Hücre çekirdekleri mavi, sitoplazmalar kırmızı boyanır). Daha sonra, bu boyanmış kesitlerin ışık mikroskobunda incelenmesiyle morfolojik (biçimlere ağırlık veren) bir değerlendirme yapılır.

Morfolojik değerlendirme, patoloğun tanıya ulaşmada kullandığı yollardan yalnızca birisidir. Patolog, yeri geldiğinde biyokimyasal, farmakolojik, mikrobiyolojik, genetik, moleküler biyolojik verileri kullanabilir; özel yöntem ve düzeneklerin yardımıyla dokular üzerinde nitel (kalitatif ) veya nicel (kantitatif) incelemeler yapabilir. Bunlar arasında

• histokimya,
• immunohistokimya,
• doku kültürü,
• in situ hibridizasyon,
• DNA sitometrisi,
• digital görüntü analizi

Patoloğun en sık kullandığı düzenek ışık mikroskobudur. Işık mikroskobu ile sağlanabilecek büyültme yaklaşık x 1000 ile sınırlıdır ve görünür ışığın dalga boyundan kaynaklanan bu sınırın teknolojik ilerleme ile aşılması mümkün değildir. Laser, X ışını, ultrasound kullanarak veya digital yöntemlerle değişik mikroskoplar yapılmakta ve bunların kendilerine özgü kullanım alanları bulunmaktadır. Günümüzde, tek tek atomların görüntülenmesine izin veren özel mikroskoplar (scanning tunneling microscope) bile geliştirilmiştir. 'Elektronmikroskop' ise, temel olarak "tarayıcı" (scanning) ve "geçişimsel" (transmission) adlı iki biçimde kullanılmaktadır. Bunların ilki, çok çarpıcı "üç boyutlu" görüntüler sağlayabilmesine rağmen, dar bir kullanım alanına sahiptir ve sık görülen hastalıkların tanısında hemen hemen hiç rolü yoktur. "Transmission" elektronmikroskopi ise daha çok araştırma amacıyla kullanılmakta, nadiren tanısal açıdan da gerekli olabilmektedir. Bu mikroskopların büyültme gücü ışık mikroskobundan yüzlerce kere fazladır. Ancak, büyültme ne kadar fazlaysa tanının o kadar kolay ve doğru olacağını düşünmek yanlış olur. Her inceleme yönteminin olduğu gibi, elektron mikroskobinin de kendine özgü bir kullanım alanı vardır.

Patoloji; doku kültürü, in situ hibridizasyon, immunohistokimya, akım sitometrisi, digital görüntü analizi gibi daha pek çok yöntemi tanısal veya araştırma amaçlı olarak kullanır. Bunların kullanımı gittikçe artmakta ve patolojik incelemede morfolojinin rolü yıldan yıla azalmaktadır. Bu, Virchow ekolünün yerini artık moleküler yaklaşımların almakta olduğunun göstergesidir; buna göre, hastalıkların değerlendirileceği temel birimler artık "hücre altı" yapılardır...

Patolog, yukarıdaki yöntemlerden biri veya birkaçı ile yaptığı incelemesinin sonunda bir rapor düzenler. Bu rapor yalnızca bir tanı içerebileceği gibi, bir ayırıcı tanı veya öneriler listesi biçiminde de olabilir. Patolog, tıbbi konsültasyon ve danışma mekanizmasının bir parçasıdır; bu nedenle, bir hasta ile ilgili düşüncesi sorulduğunda (kendisine organ veya doku örneği gönderildiğinde) bütün klinik bulgular ve değerlendirmeler hakkında bilgilendirilmelidir.

Rutin histopatolojik uygulamalar

Tespit (fiksasyon)

Dokular insan vücudundan ayrıldıkları anda canlıdırlar ve taşıdıkları hastalığın (varsa) morfolojik bulgularını sergilerler. Tespit, dokuların o andaki görünümünün ısı, nem ve enzimlerin etkisiyle değişmesini, bozulmasını önlemek amacıyla yapılır. Tespit edilmeyen dokulardaki hücreler bir süre sonra bakterilerin ve içerdikleri sindirici enzimlerin etkisiyle otolize uğrar, morfolojik özelliklerini yitirir ve tanısal amaçlı incelemelerde kullanılamayacak duruma gelirler. Tespit işlemi için genellikle özel sıvılar kullanılır. Doku ve organlar kendi hacimlerinin 10-20 katı kadar tespit sıvısı içine bırakılırlar. Patolojide rutin amaçlar için en yaygın olarak kullanılan tespit sıvısı formalindir. Bu, seyreltik bir formaldehit (H-CHO) solüsyonudur. Tespit işlemi dokunun türü ve kalınlığına göre birkaç saat (karaciğer iğne biyopsisi) ile birkaç hafta (beyin) arasında değişen sürelerde olabilir. Yüzde seksenlik etil alkol, Bouin solüsyonu, Zenker solüsyonu, B5 solüsyonu, Carnoy solüsyonu ve glutaraldehit gibi başka tespit sıvıları da yeri geldikçe kullanılabilir. Sitolojik örneklerin havada kurutulmaları veya ısıtılmaları da tespit yöntemleri arasındadır. Bu tür tespit yöntemlerine daha çok hematolojik ve mikrobiyolojik boyalar kullanılacaksa başvurulur.

Uygun formalin solüsyonunda bekletilen dokular aylar-yıllar sonra bile histopatolojik olarak rahatlıkla değerlendirilebilir.

Takip (doku işleme)

Tespitten sonraki aşamaların hemen hepsi otomatik makinelerde yapılabilir. İlk aşama, çoğunluğu sudan oluşan tespit sıvısının ve dokunun kendisinin başlangıçta içerdikleri suyun uzaklaştırılmasıdır (dehidratasyon). Bu, dokunun sertleşmesine yardım eder. Sert dokuların sonraki aşamalarda çok ince kesilebilmesi mümkün olur. (Bayat ekmekle taze ekmeğin kesilmeleri arasındaki fark gibi). Alkol, dokunun kırılganlığını artıran bir maddedir. Onun da ksilol yardımıyla ortamdan uzaklaştırılması gerekir. Daha sonra da, dokuda başlangıçta su içeren, sonra sırasıyla alkolle ve ksilolle infiltre olan aralıklara ısıtılarak sıvılaştırılmış parafinin girmesi sağlanır. Kullanılan parafin oda sıcaklığında katılaşır.

Takibe alınan bütün örnekler numaralanır. Bu numaralar sonraki bütün aşamalarda dokuların konduğu kasetlerin üzerinde, bloklarda, preparatlarda ve raporlarda yer alır.

Takip işlemleri, oda sıcaklığı ile 60 C arasındaki sıcaklıklarda yapılır. Negatif basınç (vakum) uygulanması ile, dokuların daha iyi ve daha kısa sürede işlenmeleri sağlanabilir. Ayrıca, özel mikrodalga fırınlar kullanılarak, normal olarak 8-16 saat süren bu işlemlerin süresini belirgin olarak kısaltmak ve 2 saatin altına indirmek mümkündür.

Bloklama

Parafinle infiltre edilmiş dokular, dikdörtgen prizma biçimindeki kalıplara konulur ve üzerlerine ısıtılmış parafinin dökülüp soğutulmasıyla bloklar elde edilir. Bu durumdaki dokuların çok ince kesilebilmeleri mümkün olur.

Kesme

Parafin bloklar; mikrotom adlı aygıt ile istenilen kalınlıkta (genellikle 4-5 mikron) kesilir, kesitler ılık su banyosuna, oradan da lamlar üzerine alınırlar. Bu kesitler önce ısıtılıp sonra bir solvent olan ksilole konularak deparafinize edilir, daha sonra da giderek daha sulu hale gelen alkollerden geçirilerek istenilen boyanın uygulanmasına geçilir.

Boyama

Rutin olarak kullanılan boya hematoksilen (mavi) ve eosindir (kırmızı). Kısaca "HE" veya "H&E" denilir. Bu yöntem ile, hücrelerin çekirdekleri mavi, sitoplazma olarak adlandırılan ve çekirdeği saran kısımları kırmızı-pembe boyanır. Çoğu hastalığın kesin teşhisi için bu yöntem ile boyanmış preparatların değerlendirilmesi yeterli olur.

"Frozen section" ve intraoperatif konsültasyon

Yukarıdaki rutin histopatolojik işlemlerin sağlıklı olarak yapılabilmesi için en az 10-15 saatlik bir süreye (mikrodalgalı yöntemler dışında) gereksinme vardır. Bu da, rutin patolojik incelemeye alınan bir örneğin tanısının en iyi olasılıkla ancak bir gün sonra verilebileceği anlamına gelir. Oysa, ameliyat sırasında hastada ameliyatın gidişini değiştirebilecek bir durumla karşılaşıldığında, dakikalar içinde verilecek bir tanıya gereksinme duyulabilir. Hastanın anestezi alma süresini uzatmamaya ve yeniden ameliyata alınmasına engel olmaya yönelik bir uygulama olarak "frozen section"a (dondurarak kesme) büyük hastanelerde sıkça başvurulur. Bu yöntem, dokuların istenilen incelikte kesilebilmeleri için dondurulmaları temeline dayanır. Özel bir aygıt (kriyostat) yardımıyla dokular -20 C sıcaklıkta kesilir ve hazırlanan kesitler hızlandırılmış yöntemle boyanırlar. Patolog, bu kesitleri inceleyerek vardığı sonucu ameliyatı yapan cerraha bildirir. Bütün bu işlemler, ameliyathaneye komşu bir patoloji bölümünde yapıldığında, 10-15 dakika kadar sürer. Bazı patoloji bölümlerinin ameliyathane içinde bu amaçla çalışan bir birimi bulunmaktadır.

Dondurarak kesme yöntemiyle hazırlanan kesitlerin değerlendirilmesi güçtür ve bu işlem ancak deneyimli patologlar tarafından yapılabilir. Cerrahlar patologlardan "intraoperatif histolojik inceleme" istediklerinde, bu isteklerini mümkünse operasyondan önce, değilse operasyon sırasında ve hasta hakkındaki tüm önemli bilgileri sunarak iletmelidirler. İletişim eksikliği, intraoperatif histolojik incelemeden istenilen verimin alınmasını engeller ve bu uygulamanın hastaya zarar vermesine bile yol açabilir.

Sitolojik yöntemler

Dokuların insan vücudundan hiç can yakmadan alınması mümkün değil gibidir. Hastalar, seçme şansları olduğunda, tanılarının canları yakılmadan konulmasını tercih ederler. Gelişmiş ülkelerde hastaların bilinçlenmesine ve tıp teknolojisinin gelişmesine paralel olarak, doku almadan da morfolojik değerlendirme yapılabilmesini sağlayan yöntemler hızla yaygınlaşmaktadır. Romanyalı Dr. Aurel Babes tarafından 1927'de ilk kez bildirilen, 1950'lerde George Papanicolaou tarafından yaygınlaştırılan servikovaginal yayma yöntemiyle, rahim ağzından kendiliğinden dökülen hücrelerin morfolojik olarak incelenmesiyle, bir kanserin daha klinik bulgu vermeden yakalanabileceği ilk kez ve kesin olarak gösterilmiştir. Bu yöntemin uygulanması sayesinde, bugün kadınların serviks kanserinden ölmelerine seyrek rastlanmakta ve çoğu kanser daha oluşma aşamasındayken tam olarak çıkarılabilmektedir.

Kapladıkları yüzeyden dökülen hücrelerin sitolojik olarak incelenmelerine 'eksfolyatif sitoloji' denilmektedir. (Servikovaginal yayma ve idrar sitolojisi gibi). Ayrıca, bu yöntemle birlikte veya ondan ayrı olarak, deri ve mukozayı kazıyarak hücre elde etmek mümkündür (kazıma yöntemi). Gittikçe yaygınlaşmakta olan 'aspirasyon sitolojisi' yöntemi ise, ulaşabileceği doku ve organların hemen hemen sınırsız olmasıyla diğer bütün sitolojik yöntemlerden ayrılmaktadır. Bu yöntemle, palpe edilebilen bütün organlardaki lezyonlara anesteziye ve özel aletlere gerek duyulmadan ince (dar çaplı) bir enjeksiyon iğnesiyle girilmekte ve aspire edilen hücreler lamlara yayılmaktadır. Derindeki organlara da ultrasound veya bilgisayarlı tomografi gibi görüntüleme yöntemleri eşliğinde girilebilmektedir. Elde edilen hücrelerin değerlendirilmesinde, her organ için ayrı bir bilgi birikimine ve deneyime gereksinme vardır. Bu nedenle, yöntemin yaygınlaşmasının önündeki en büyük engel, bu konuda yetişmiş patolog sayısının azlığıdır. Bir sitolojik incelemenin sonucu değişik koşullarda değişik anlamlar taşıyabileceği için, bu yöntemi uygulamak isteyen klinik doktorlarının patolog ile yakın ilişkide olmaları zorunludur. Dünyada ve ülkemizde pek çok birimde, yüzeysel lezyonların aspirasyonu da patolog tarafından yapılmaktadır. Bu yolla; örneklerin daha iyi alınması, gerekirse aspirasyonun hemen tekrarlanabilmesi ve tanının hem daha çabuk hem daha doğru konulması mümkün olmaktadır.

Sonuç

Patoloji; anatomi ve fizyolojide öğrenilen bilgilere, hastalıklı organların çıplak gözle veya mikroskop altındaki anormal görünüşlerini ekleyerek hastalıkların daha kolay anlaşılmasını sağlar. Görünüşlerin karar vermeye çok yardımcı olduğu alanlarda, patolojik incelemenin tanıya ve uygun tedavi yönteminin belirlenmesine katkısı da çok büyüktür. Günümüzde, tümörlerin tanısı başta olmak üzere, pek çok hastalığın kesin tanısı için patolojik inceleme gerekli ve zorunludur.